李博安教授团队开发基于熔解曲线分析的在一管中免提快检CYP2C19*2/3/17多态性的检测方法

  单核苷酸多态性（SNP）涉及一个碱基的差异，具有重要的临床意义。同一种疾病的患者服用相同的药物时，可能会出现不同的反应，药物分为显效、有效、无效。一个SNP就可能改变蛋白的表达，从而改变药物的靶位点，使其亲和力降低或缺乏。因此，SNP分析有助于实现正确的诊断和有效治疗。

一些传统的检测SNP的方法，如双脱氧测序、焦磷酸测序、全基因组测序、qPCR等，可以揭示SNP相关重要特征，如识别SNP的类型及其准确位置。但这些方法操作繁琐，价格昂贵，不适合普遍使用。近期，研究团队开发了一种基于PCR扩增结合熔解曲线分析的检测策略，可在1管内同时检测3个SNP位点CYP2C19 * 2 / 3 / 17共9种基因型，并在1 h内实现快速检测，该研究成果以题为“An Extraction-Free Method for Rapid Detection of CYP2C19 * 2/3/17 Polymorphisms in One Tube using Melting Curve Analysis”的研究论文在线发表于BIOTECHNOLOGY JOURNAL。

该研究通过不对称扩增方式对初始模板进行扩增，使用相邻探针和Taqman探针相结合的方式进行检测。CYP2C19 * 2探针的3 '端修饰FAM荧光基团，相邻间隔1碱基的第二段探针的5 '端修饰BHQ1淬灭基团，3 ' 端修饰磷酸基团P以阻断延伸。同样，CYP2C19 * 17的第一段探针的3' 端修饰荧光团为ROX，第二段探针的猝灭基团为BHQ2。在研究过程中发现，一管中多个相邻探针的存在会导致引物和探针之间的相互干扰。相邻探针检测的方法最终可以在一管中容纳两个多态性位点。因此，我们将Taqman探针与相邻探针相结合。CYP2C19 * 3设计为Taqman探针：5 '端由HEX荧光团修饰，3 '端携带BHQ1淬灭基团。由于探针与模板链的结合力随着温度的升高而降低，因此出现了熔解峰。由于纯合野生型和突变型样品之间存在一个碱基的差异，因此在熔解阶段Tm值不同，最终的检测结果表现出不同的Tm值。

此外，结合样本释放剂，可快速提取样本，数秒即可完成提取，同时该检测系统不局限于血液样本，还可以应用于口咽和唾液样本，增加了采样的多样性和便利性。我们同时检测了93例临床血液样本，验证了我们建立的检测体系能够快速、准确地鉴别不同基因型，并且通过Sanger测序验证了检测的准确性和有效性。基于实时聚合酶扩增结合熔解曲线分析的检测技术因其准确、快速、操作简单、成本低等优点，将成为检测和指导氯吡格雷使用的有力工具。

该论文的第一作者为厦门大学生命科学学院博士生郭剑光，博士生尤伟鑫为本文的共同第一作者，厦门大学生命科学学院李博安教授和厦门大学附属第一医院张睿博士为该文章的共同通讯作者。本项目得到国家重点研发计划（2020YFA0112300）、国家自然科学基金（81972458，82103092）、厦门细胞治疗研究项目（3502Z20214001）、福建省自然科学基金项目（2022J05312）、福建省健康教育联合研究项目（2019-WJ-34）和" 111计划"由国家外国专家局和教育部主办（B06016）的资助。

论文链接：https://doi.org/10.1002/biot.202300207