李博安教授团队开发基于CRISPR/Cas12a不受PAM限制的一步法核酸快检技术

近几十年来，由病原体百日咳杆菌（BP）、流感病毒、SARS-CoV-2等引起的呼吸道传染病严重威胁着人类健康，尤其是2019年爆发的2019年冠状病毒病（新冠肺炎）。核酸的快速、早期和准确检测对于疾病的诊断、治疗方案的评估、预防措施的制定、耐药性的评估等具有重要意义，这反过来可以防止疾病传播的风险。

CRISPR自问世以来因其快速、敏感、特异性强、反应恒温等特点，被广泛的用于分子诊断，如张锋团队建立的SHERLOCK核酸检测平台、Jennifer 团队建立的DETECTR检测技术等。然而，这些基于CRISPR/Cas的检测策略，crRNA的设计受到原间隔物相邻基序位点（PAM）序列限制，且通常需要分步骤进行，要求首先对核酸进行预扩增，然后将扩增产物转移到CRISPR/Cas系统进行核酸检测，这种多步骤反应方法不仅麻烦且耗时，而且容易受到气溶胶污染的影响。为了避免开盖污染这个问题，李博安团队前期将CRISPR技术与微流控芯片结合，实现反应自动化，避免了额外的移液步骤（(Sun et al., Science China-Chemistry，2022）。近期，研究团队在进一步的研究中开发了一种不受PAM限制的一步法核酸检测技术，恒温扩增与基因编辑检测在同一个反应管里进行，无需产物转移步骤，简单方便且敏感度高，该研究成果以题为“Fast and visual detection of nucleic acids using a one-step RPA-CRISPR detection (ORCD) system unrestricted by the PAM”的研究论文在线发表于ANALYTICA CHIMICA ACTA。

该研究通过对CRISPR/Cas12a识别PAM和非PAM靶标的切割活性进行研究，发现与识别PAM靶标对比，Cas12a识别非PAM靶标的cis切割靶标模版的能力明显变弱，但trans切割单链DNA探针的能力保持不变。研究团队随即将CRISPR/Cas12a与RPA恒温扩增技术结合，一步法检测64种随机的PAM（TTTN）靶标，发现在一步CRISPR检测中，最优选的PAM序列TTT和含有两个T（TTN、NTT、TNT）的靶标在ORCD中表现出较差的性能，而TCC、TCG、CCT、CTC、GTC和CTG在ORCD上表现出优异的活性。进一步研究发现，降低CRISPR/Cas12a的cis切割活性，使CRISPR一步检测PAM靶标的敏感度提高了1000倍，意味着cis切割活性是CRISPR一步法检测的关键。

采用非PAM序列，CRISPR一步法检测速度快且敏感度高特异性强，30分钟之内能实现单拷贝的DNA和RNA检测。并且与核酸免提取技术结合，ORCD系统可在30分钟内完成提取、扩增和检测样本，在临床应用上检测了82例百日咳博德特氏菌临床样本，与PCR相比，灵敏度和特异性分别为97.30%和100%。此外，RT-ORCD检测了13例SARS-CoV-2样本，结果与RT–PCR一致。并且仅用便携式紫外灯或蓝光灯照射即可观察到结果。这种不受PAM限制、一步、快速、结果可视化、高敏感度和特异性的核酸检测方法，在后疫情时代的POCT分子诊断的未来发展中显示出巨大的潜力。它可以广泛用于在非专业环境中快速检测传染病，例如小型诊所、机场、田野和其他地方。

该论文的第一作者为厦门大学生命科学学院博士生林康凤，博士生郭剑光和硕士生郭祥举为本文的共同第一作者，厦门大学生命科学学院李博安教授、厦门大学附属第一医院张睿博士和厦门市妇幼保健院吴谨准教授为该文章的共同通讯作者。本项目得到国家重点研发计划（2020YFA0112300）、国家自然科学基金（81972458，32071150）、福建省健康教育联合研究项目（2019-WJ-34）的资助。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.340938

（图/文 李博安团队）