李博安教授团队开发基于RAA-CRISPR/Cas12b的一步法核酸快检技术

百日咳是一种由百日咳杆菌引起的急性呼吸道感染，早期诊断对于百日咳的治疗至关重要。目前，实验室诊断百日咳常用的方法有:培养法、直接荧光抗体检测、聚合酶链反应(PCR)、配对及单一血清学技术。通过培养分离百日咳杆菌是诊断百日咳的传统“金标准”，具有大约100%的特异性。然而，基于培养的方法的灵敏度很差，在12% ~ 60%之间，而且这些方法非常耗时，平均需要5天。

传统的PCR或逆转录PCR (RT-PCR)方法是核酸检测的金标准，自20世纪90年代以来，PCR已被用作临床和非临床研究环境中百日咳的诊断工具。然而，PCR技术需要专业的人员和设备基础设施，并且从采样到结果的时间也很长，不适合简单快速的即时检测(POC)。核酸等温检测技术，如重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶辅助扩增(RAA)和环介导等温扩增(LAMP)等，具有操作简单、恒温、快速等优点，在POC中具有很大的潜力。令人沮丧的是，它们的应用受到限制，因为与qPCR相比，它们的灵敏度较低，而且可能出现假阳性结果。

近年来，基于CRISPR/Cas的核酸检测方法已广泛运用于分子诊断。将CRISPR/Cas核酸酶蛋白与等温扩增技术相结合，开发了一系列不需要特殊精密仪器的简单、快速、灵敏、可视化的核酸检测方法。例如，基于Cas13a或Cas13b的SHERLOCK核酸检测平台，基于Cas12a的DETECTR检测技术，以及基于Cas12b的CDetection的检测方法可以实现核酸的快速检测。然而，这些方法需要两个步骤，首先扩增目标序列，然后进行CRISPR检测。这样的多个处理步骤增加了操作时间和交叉污染的风险。

STOPCovid (SHERLOCK Testing in One Pot)和STOPCovid v2在开发耐热型嗜酸芽孢杆菌Cas12b (AapCas12b)的基础上，设计了RT-LAMP来解决两步法的问题。但是，这些基于LAMP的一锅检测需要较长的反应时间，反应温度为60℃，这限制了LAMP的引物设计，而且温度高容易造成烧伤，不适合在家庭等场所进行检测。李博安团队在之前的研究中发现，CRISPR-Cas蛋白的低顺式裂解活性和高反式裂解活性是结合核酸扩增一步检测的关键，开发了一种不受PAM限制的一步法核酸检测技术。近期，研究团队发现在较低温度下，AacCas12b仍保持较高的反式裂解活性，而顺式裂解活性极弱，在此基础上建立了RAA-CRISPR/Cas12b单锅检测(Rcod)系统。该研究成果以题为“Rapid and sensitive detection of nucleic acids using an RAA-CRISPR/Cas12b one-pot detection assay (Rcod)”的研究论文在线发表于Talanta。

该研究发现AacCas12b在30◦C~39◦C温度范围内仍然具有较高的反式裂解活性，和较低的顺式裂解活性，使得AacCas12b和较低温度的等温扩增（如RAA）建立一锅法成为可能。在Rcod体系中，AacCas12b的裂解和等温扩增同时发生在一个试管中，具有高反式裂解活性和低顺式裂解活性的AacCas12b对体系中核酸的干扰弱于具有高顺式裂解活性的AacCas12b，展现出较高的灵敏度和可靠性。

与传统的基于CRISPR的检测方法相比，直接在一管中进行RAA扩增和AacCas12b切割的系统更方便实现，避免了两步法的繁琐操作。与其他Cas12b一步检测方法相比，Rcod系统具有灵敏度高(0.2 copies/μL)、耗时短(30 min以内)的优点。与实时荧光定量PCR相比，Rcod联合无核酸提取法在30 min内对221份临床标本进行百日咳检测，灵敏度为97.96%，特异性为99.19%，准确率为98.64%。总之，Rcod系统是一种一步、简单、快速的核酸检测方法，具有较高的灵敏度和特异性，为POC的诊断提供了一种快速的诊断方法。

该论文的第一作者为厦门大学生命科学学院博士生林康凤，国家儿童医学中心姚开虎教授以及厦门大学生命科学学院硕士生李箫和李清涵为本文的共同第一作者，厦门大学生命科学学院李博安教授、厦门大学医学院李志勇教授和厦门大学医学院杨晓庆教授为该文章的共同通讯作者。